【期刊导读】聚乙二醇干扰素α治疗期间miR

2023-02-14 10:15:00 作者:乙肝新闻 人气:

导读:编者按:目前HBV感染仍是全球重要的公共卫生问题。牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)是HBV进入肝细胞所需的受体之一。HBV进入肝细胞后形成共价闭合环状DNA(cccDNA),cccDNA半衰期较...

编者按:目前HBV感染仍是全球重要的公共卫生问题。牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)是HBV进入肝细胞所需的受体之一。HBV进入肝细胞后形成共价闭合环状DNA(cccDNA),cccDNA半衰期较长,无需新的病毒进入肝细胞即可自我补充,保持一定数量的转录模板。因此,抑制HBV进入肝细胞在预防HBV感染中至关重要。

早前日本研究团队已证实了在聚乙二醇干扰素α(PEG IFNα)治疗期间,血清miR-6126水平的升高预示着HBsAg的降低,且体外实验也说明了miR-6126能够抑制HBsAg的产生和HBV复制。这表明miR-6126具有抑制HBV病毒活性的潜力,但潜在机制尚不清楚。

【期刊导读】聚乙二醇干扰素α治疗期间miR-6126下调肝细胞中NTCP的表达,抑制HBV进入

近期,该研究团队的最新成果发表在Gene上,通过体外实验探索miR-6126是否下调了NTCP的表达水平,结果显示:转染miR-6126降低了HepG2-NTCP细胞中NTCP的表达水平,且miR-6126下调了NTCP mRNA的表达,这与miR-6126抑制HBV进入肝细胞有关。

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研究方法

HepG2-NTCP细胞是过表达牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)-1的肝癌细胞株,用于评估转染miR-6126后NTCP的表达水平和PreS1附着在NTCP上的情况。TaqMan基因表达分析用于检测NTCP和β-肌动蛋白(β-actin)的基因表达水平。Western blot分析和免疫染色法评估NTCP蛋白表达水平。

人原代肝细胞PXB细胞从接种PHH的尿激酶型纤溶酶原激活物转基因/SCID小鼠中分离出来,用于验证miR-6126对PreS1附着在NTCP的抑制作用。酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中HBsAg水平,以评估HBV进入肝细胞的减少程度。

评估NTCP mRNA的稳定性,以确定NTCP mRNA下调的原因。计算治疗组和对照组之间miRNA表达水平的差异倍数。

研究结果

01 miR-6126抑制了NTCP表达和PreS1抗原附着于细胞表面

Western blot分析表明在HepG2-NTCP细胞中50 nm的miR-6126抑制了NTCP表达,而50 nm的miR-6126抑制剂会增强NTCP表达水平。免疫染色法也表明了50 nm的miR-6126抑制了NTCP表达。基于胞浆的面积比例,NTCP染色的面积随miR-6126转染而显著降低。

转染miR-6126后HepG2-NTCP细胞和人原代肝细胞PXB细胞中PreS1抗原对细胞表面的附着下降。

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图1:Western blot分析(A)和免疫染色法(B)评估NTCP表达水平

02 miR-6126降低了NTCP mRNA的稳定性及HBsAg水平

在HepG2-NTCP细胞中,通过放线菌素D(5 μg/mL)抑制mRNA合成,miR-6126转染组的NTCP残留mRNA的下降比阴性对照组更快。

在PXB细胞中,miR-6126转染组的HBsAg水平显著低于阴性对照组。

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图2:miR-6126转染组与阴性对照组的NTCP mRNA稳定性和HBsAg水平

03 miR-6126引起转录组变化和miRNA表达谱改变,下调了NTCP mRNA的表达水平

在NTCP的3'UTR、5'UTR和CDS序列中,使用miRNA目标序列motif来搜索,均未发现miR-6126可能的靶点。

在HepG2-NTCP细胞中转染miR-6126后,与阴性对照相比,4个mRNAs表达水平上调,25个mRNAs表达水平下调。转录组数据已上传NCBI数据库(登录号:GSE192617)。

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图3:miR-6126转染24小时后的转录组分析

miRNAs微阵列分析表明miR-6126等9个miRNAs上调,7个miRNAs下调。miRNA芯片数据已上传NCBI数据库(登录号:GSE180543)。

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图4:miR-6126转染24小时后的miRNAs微阵列分析

肝霖君有话说

本研究发现HepG2-NTCP细胞转染miR-6126后NTCP的表达水平下调、并且miR-6126通过降低NTCP mRNA稳定性从而下调其mRNA水平。PXB细胞转染miR-6126后PreS1抗原附着于细胞表面减少,且HBsAg水平显著下降。这表明miR-6126可通过下调NTCP,抑制HBV进入肝细胞,从而减少cccDNA合成。而之前的研究已显示在聚乙二醇干扰素α治疗期间,血清miR-6126水平的升高预示着HBsAg的降低。

已有多项研究也对干扰素α清除cccDNA的机制进行了探索,郭巨涛教授团队发现干扰素α可通过诱导募集到cccDNA微染色体上的三种细胞蛋白来改变组蛋白翻译后修饰,并协同抑制cccDNA转录(相关链接)。宁琴教授团队揭示IFNα可通过介导细胞外泌体miRNA清除cccDNA(相关链接)。张晓东教授团队发现干扰素α可抑制cccDNA上GCN5介导的组蛋白琥珀酰化作用从而通过表观遗传调控来清除cccDNA(相关链接)。目前基于聚乙二醇干扰素α的治疗策略可提升慢乙肝临床治愈率,对其作用机制的深入探索研究将有助于进一步优化治疗方案,推进治愈率的进一步提升。

参考文献:

Fujita K, Nishitsuji H, Iwama H, et al. Pegylated interferon therapy-related microRNA-6126 downregulates sodium taurocholate cotransporting polypeptide expression in hepatocytes [J]. Gene, 2022, 22: 147068

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